NK细胞免疫疗法,NK细胞疗法,新NK细胞治疗技术证实抗癌成功

　　NK细胞最早是在1975年发现的，是先天性效应淋巴细胞，不同于T细胞和B细胞。NK细胞的优势就是，能够不需要任何条件的致敏作用，NK细胞单凭自身实力就能够找到癌细胞或者其他异常细胞进行消灭，省去很多繁杂的步骤，是最先冲刺到一线进行战斗的天然免疫屏障。

　　 nk细胞

　　NK细胞的前世今生

　　NK细胞在骨髓(BM)中常见淋巴祖细胞发育而来，存在于原发和继发淋巴组织内，也存在于非淋巴组织内，包括肺、肝和外周血(PB)等。在所有循环的淋巴细胞中，有10–15%被认为是NK细胞。在人类中，这些细胞的特点是CD3 - CD56 +淋巴细胞。

　　 nk细胞培养前后

　　右图中绿色框中红色面积明显大于左图，代表CD16+/CD56+细胞含量多，即经过12天的培养，NK细胞越来越多

　　根据细胞表面CD56的密度，已将人类NK细胞分为两个不同的亚群：CD56 明亮 CD16 暗淡NK细胞，也称为未成熟NK细胞，是细胞因子的产生者，尤其是干扰素γ(IFNγ)，它们在免疫调节中起着重要的作用。CD56 暗淡 CD16 明亮 NK细胞，称为成熟NK细胞，是外周血中NK细胞的大部分(90%)，在介导NK细胞的免疫功能中起重要作用。

　　NK细胞为何有强大的抗肿瘤活性

　　那么，了解完NK细胞的前世今生了，到底NK细胞是如何发挥抗癌功能的呢?

　　NK细胞在免疫先天防御系统中的关键作用，摧毁、溶掉各种异常或癌细胞。与其他淋巴细胞不同，NK细胞的识别不受抗原特异性的控制，而是受激活受体和抑制受体信号的整合控制，激活受体和抑制受体的信号被假定靶细胞上表达的配体所吸收。可以识别人白细胞抗原I类(HLA-1)或I类分子的抑制受体。

　　由于HLA-1几乎在所有有核细胞上表达，因此在抑制受体募集后，抑制反应可作为“自我”的识别，从而抑制NK细胞活化并防止“自我”裂解攻击。

　　释放穿孔素和颗粒酶直接溶瘤

　　NK细胞对靶细胞的直接细胞毒性被认为严重依赖于诸如，穿孔素和颗粒酶等溶细胞性颗粒的直接杀伤作用。NK细胞将被激活并分泌细胞毒性颗粒以杀死肿瘤细胞

　　死亡受体介导癌细胞凋亡

　　死亡受体介导的异常细胞或应激细胞的凋亡过程也是直接杀死的一种方式。半胱天冬酶酶促级联反应诱导的凋亡是由NK细胞上表达的DR(例如FasL，TRAIL)与其靶细胞上的配体之间的相互作用触发的。

　　死亡受体介导癌细胞凋亡

　　我们最熟悉的死亡受体就是PD-1，PD-1是一些活化的淋巴细胞(包括B细胞、T细胞和NK细胞)表达的抑制性受体。PD-1可以在癌症患者的NK细胞上表达，并诱导活化的NK细胞功能衰竭。因此，许多抗PD-1抗体，包括nivolumab(纳武单抗)，ipidilizumab(伊匹单抗，CTLA-4抗体)和pembrolizumab(派姆单抗)等免疫检查点抑制剂已经获批用于肿瘤治疗。值得研究PD-1抗体增强的内源性NK细胞细胞毒性。

　　抗体依赖细胞毒性的杀伤作用

　　另一个直接的杀伤机制涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。ADCC通常由人体中的免疫球蛋白G(IgG)介导。例如，hu14.18-IL2是一种人源化单克隆抗体，研究证明，它可以有效治疗晚期黑色素瘤或成神经细胞瘤的患者。

　　细胞因子激活NK活性间接抗肿瘤

　　此外，NK细胞可以通过产生趋化因子和细胞因子来间接作用，从而杀死癌细胞并调节先天和后天免疫应答。白细胞介素(IL)-2，IL-15，IL-12，IL-21以及IL-18是提高NK细胞的抗肿瘤作用和在体外和体内提高其增殖活性的关键细胞因子。其中IL-2和IL-15研究最多。

　　细胞因子激活NK活性间接抗肿瘤

　　向患者施用刺激性细胞因子(IL-2或者IL-5)和抗体会触发自体NK细胞的活化和扩增，并增强其抗肿瘤活性

　　IL-2最初在30多年前被发现为T细胞生长因子，如今已成为用于增强NK细胞细胞毒性的最受欢迎的细胞因子之一，但大剂量会造成严重的副作用，包括血管渗漏和器官损伤。目前，已经采用名为“ super-2”的IL-2突变体取代IL-2，另外研究者创建一种IL-2突变体的重组融合蛋白，两种方法都能够降低副作用，而开启NK细胞的激活能力。

　　IL-15也是IL-12的替代品，是NK细胞发挥细胞毒性、体内稳态和发育中主要的细胞因子。研究表明，在第一个将重组人(rh)IL-15注入患有转移性恶性肿瘤的患者的临床试验中，在患者中观察到NK细胞增殖，与两名患者显示出肺部病变的清除。

　　此外，的I期临床试验报告称，皮下注射rhIL-15显着促进循环NK细胞和CD8 + T细胞(尤其是CD56 亮 NK细胞)的增殖。实际上，正在进行多项临床试验(NCT03759184：obinutuzumab;NCT02689453：alemtuzumab;NCT03388632：nivolumab和ipilimumab;NCT03905135：avelumab)正在研究与抗体结合的rhIL-15在抗肿瘤中的作用。

　　如何恢复癌症患者的NK细胞功能呢

　　过继性NK细胞免疫疗法

　　通过注入离体激活的同种异体NK细胞或嵌合抗原受体(CAR)修饰的NK细胞，获得大量、高质量地过继转移NK细胞是取代、恢复和改善免疫系统功能的直接和基本方法，并且具有已被证明是针对肿瘤细胞的一种有前途的细胞免疫疗法。

　　细胞因子激活NK活性间接抗肿瘤

　　(i)从PBMC(外周血)、NK细胞系或hPSC(胚胎干细胞)培养获得的NK细胞可直接或与免疫刺激剂一起注入患者体内。

　　(ii)将NK细胞设计为表达嵌合抗原受体(CAR)，离体扩增之后再回输给患者。

　　研究证实，源自癌症患者的自体NK细胞实际上处于免疫抑制状态，功能受损，使得这些细胞难以表现出抗肿瘤能力。这也就说明了，为什么很多时候需要用异体细胞来培育高度活化的NK细胞。

　　在血液系统恶性肿瘤的临床试验以及包括黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、成神经细胞瘤、肾细胞癌、结直肠癌和肝细胞癌在内的实体瘤试验中，同种异体外周血培养的NK细胞已被广泛用作免疫疗法抗肿瘤。

　　NK细胞培养技术发展道路波折崎岖

　　最初使用诸如IL-2和IL-15的细胞因子进行离体培养和从外周血扩增原代NK细胞。

　　然而，仅通过暴露于细胞因子很难获得大量功能性NK细胞。随后，开发了人工抗原呈递细胞(aAPC)作为饲养细胞，用于离体扩增NK细胞，但是获得的临床数据并不理想。

　　后来，通过克隆NK细胞系，例如NK-92，KHYG-1，HANK-1，NKG，NK-YS，YTS，YT，NK3.3和NKL均可在培养基中轻松扩增和繁殖。其中，NK-92是唯一获得美国FDA批准用于临床试验的细胞系。其中，NK-92细胞有限的临床效率主要是由于CD16表达的缺乏及其在体内的短寿命造成。

　　 NK细胞培养

　　为了克服这些障碍，已经成功开发了高亲和力自然杀伤(haNK)细胞，该细胞是改造成CD16A(158VV)受体和内源性IL-2的NK-92细胞系的变体。目前，正在研究实体瘤患者中haNK细胞的可行性(NCT03027128)，已经取得了可喜的数据。

　　全新haNK细胞治疗技术已成功

　　haNK细胞是在现有的NK细胞平台基础上开发出来的，并在1期临床试验中完成治疗，并已证明其具有杀死癌症的潜力。与正常NK细胞不同，这种独特的NK细胞(aNK)不表达杀伤抑制受体(Killer Inhibitory Receptor，KIR)，KIR是癌细胞经常利用来逃避NK细胞追杀的防护盾牌。

　　而优化后的活化NK细胞(haNK)，它们不表达这些抑制性受体，同时保留了广泛的活化受体，可以选择性靶向和杀死癌细胞，还携带较大的颗粒酶和含有穿孔素的颗粒，从而使它们能够向多个靶标传递大量的致命酶，不给癌细胞喘息之机。

　　 haNK细胞治疗技术

　　aNK细胞疗法对比CAR-T疗法的优势：制备过程简便;适用人群广泛;副作用小;等。

　　近期，一项使用制备成功的活化的自然杀伤细胞(active Natural killer cell，aNK)进行2期临床研究的试验数据在2019 SITC (癌症免疫治疗大会)年会上公布。

　　该研究证明，在转移性默克尔细胞癌(MCC)患者中，全新NK细胞疗法与N-803(IL-15的超激动剂)联合使用，在7例晚期难治性MCC患者中，有2位患者具有长期、持久的反应。其中一位患者实现了影像学的完全缓解(可见肿瘤病灶消失并持续4周以上)，而另一位获得了持久的部分缓解，肿瘤消退率超过75%，并且之后没有后续治疗(迄今为止仍在处于缓解状态)。该试验中的两名患者均反应良好，截止到随访时，两位患者从治疗开始已经存活了29个月(约3年)和44个月(约4年)。

　　活化的NK细胞疗法(aNK)的安全性以及它们对多种癌症的治疗效果相关的临床试验，已经在加拿大和欧洲进行了I期临床试验，在美国进行了多个I和II期临床试验。

　　NK细胞治疗流程

　　 NK细胞治疗流程